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O agronegócio destaca-se economicamente, contribuindo com 21,4% do Produto Interno Bruto (PIB) no ano de 2019 (BRASIL, 2020). O rebanho de bovinos leiteiros, com um valor bruto de produção de 33 bilhões de reais anuais (IBGE, 2020), se sobressai economicamente, no entanto, cresce a preocupação com os impactos ambientais visto a geração de grandes volumes de dejetos, fontes de contaminação e proliferação de microrganismos patógenos (MEDEIROS et al., 2016). Nesse contexto, a digestão anaeróbia configura-se como uma alternativa sustentável, capaz de produzir subprodutos, biogás e biofertilizante, economicamente vantajosos (KOUGIAS et al., 2017). O biogás é composto principalmente de metano (50-70%), dióxido de carbono (25-50%) e gás sulfídrico (0-3%), com um poder calorífico aproximado de 7.000 kcal/m³ (CHERNICHARO, 2007), enquanto o biofertilizante é rico em nutrientes e material orgânico (BARBOSA; LANGER, 2011). O objetivo deste trabalho foi avaliar a redução de microrganismos termotolerantes no final do processo de biodigestão anaeróbia de efluentes da pecuária bovina leiteira, em dois tratamentos, com e sem inoculação. Foram utilizados 30 biodigestores em batelada de 1,8 litros com dejeto bovino coletado na Fazenda Experimental da Zootecnia da UNESP de Botucatu-SP. O inóculo foi obtido do efluente de biodigestores de uma fazenda em São Pedro-SP. Em cada tratamento, diluição do efluente em água ou com inóculo, um biodigestor foi utilizado para retirada das amostras iniciais. Da mesma forma, no final de 70 dias outros biodigestores foram utilizados para a retirada das amostras finais. Posteriormente, foi realizada a extração de DNA das amostras e em seguida o sequenciamento no Sistema Illumina MiSeq. Os dados do sequenciamento foram tratados pelo 16S Metagenomics App na plataforma de análise BaseSpace e enquadrados na classificação taxonômica (reino, filo, classe, ordem, família, gênero e espécie). De forma geral, do total de 892.774 Reads (componente quantitativo) do sequenciamento, 74,8% foram efetivamente identificados quanto ao gênero, o que resultou em um total de 728 microrganismos diferentes (componente qualitativo). As amostras com inóculo apresentaram identificação global (amostras iniciais e finais) na classificação de gênero em 65,5% dos Reads, ao passo que nas amostras sem inóculo, obteve-se 83,6%. Quanto aos microrganismos termotolerantes identificados, observou-se ao final de 70 dias uma redução de 100% da contagem no tratamento com inóculo e de 80% sem inóculo, enquadrando-se nas regulamentações mínimas permitidas (CONAMA, 2005; CETESB, 2018). Conclui-se que o tratamento com inóculo possibilitou uma segurança maior ao utilizar o biofertilizante, com a ausência de organismos de contaminação fecal prejudiciais à saúde após 70 dias. Os resultados corroboram-se com a hipótese de que o inóculo contribui para acelerar o processo e, consequentemente, a diminuição dos microrganismos termotolerantes durante a digestão anaeróbia.